Naukowcy z Politechniki Wrocławskiej pozyskali cytometr masowy – najnowocześniejsze obecnie urządzenie do analizy i diagnostyki próbek komórkowych oraz zaawansowanej proteomiki. To obecnie jedyne tego typu urządzenie w Polsce i będzie ono stanowić jeden z kluczowych elementów aparaturowych unikalnego Laboratorium Obrazowania tworzonego przez prof. Marcina Drąga na Wydziale Chemicznym PWr.

Cytometria jest jedną z metod diagnostycznych, która umożliwia m.in. analizę różnorodnych parametrów badanych komórek. Dotychczas najpopularniejszymi aparatami do prowadzenia tego typu badań były opierające się na pomiarach fluorescencyjnych cytometry przepływowe, w których analizowano odpowiednio wyznakowane komórki np. pobrane metodą biopsji czy wyhodowane w laboratorium. Urządzenia te są w stanie przeprowadzić analizę ok. 10-15 różnych parametrów  komórkowych m.in. wielkość, czy intensywności fluorescencji badanych elementów, głównie białek.

Najbardziej zaawansowanym technicznie dostępnym obecnie na rynku aparatem, wykorzystywanym w tego typu testach jest jednak cytometr masowy, który właśnie trafił na Politechnikę Wrocławską. Cytometria masowa to stosunkowo młoda technika analityczna, niemniej w ostatnim czasie już znacząco zrewolucjonizowała nowoczesną diagnostykę medyczną zarówno w laboratoriach akademickich jak i przemyśle farmaceutycznym. Przy prowadzeniu analiz zakłada ona wykorzystanie spektrometrii masowej, czyli badania próbki przy pomocy analizy widma mas atomów metali, które używane są w tej metodzie jako znaczniki.

Szybsza i lepsza analiza

Cytometr masowy jest więc używany do multiparametrycznej analizy próbek, głównie komórek, które w tym procesie znaczone są stabilnymi izotopami metali przejściowych, głównie lantanowców.

Multiparametryczna analiza oznacza, że w trakcie jednego eksperymentu jesteśmy w stanie poznać i określić wiele parametrów na poziomie poszczególnych komórek. O ile jednak cytometry przepływowe mogą podać kilkanaście wyników, to cytometry masowe przeprowadzają analizę nawet kilkudziesięciu różnych parametrów – tłumaczy prof. Marcin Drąg z Zakładu Chemii Bioorganicznej Wydziału Chemicznego PWr.

Wyniki badań komórek w cytometrze masowym są również o wiele bardziej rozbudowane, oszczędza się także czas, bo jedną próbkę można oznaczyć wieloma metalami. Co ważne, w urządzeniu można badać komórki każdego typu np. komórki z guzów nowotworowych czy białaczki, komórki krwi czy nawet komórki pochodzące z innych organizmów (pasożytów, czy bakterii).

Tak naprawdę nie ma żadnych ograniczeń co do badań realizowanych przy pomocy cytometru masowego. Ogranicza nas jedynie technika i jakość naszej pracy przy sporządzaniu próbki. Kluczowym aspektem jest tu właśnie odpowiednie przygotowanie badanego materiału, bo sama jego analiza opiera się głównie na odpowiednich algorytmach komputerowych, choć oczywiście trzeba wiedzieć jakich algorytmów użyć do danego typu eksperymentu – dodaje dr inż. Marcin Poręba z Zakładu Chemii Bioorganicznej Wydziału Chemicznego PWr, który pracował już na cytometrze masowym podczas swojego stażu podoktorskiego w USA, a na Wydziale Chemicznym PWr będzie koordynował badania z użyciem tej aparatury.

Cytometr, który będzie wykorzystywany na naszej uczelni, to urządzenie trzeciej generacji i obecnie najbardziej technologicznie zaawansowany model. Posiada dużo bardziej czuły spektrometr masowy z większą ilością kanałów do detekcji metali niż poprzednie modele, najnowsze oprogramowanie, jest on też bardziej wydajny i dużo mniej awaryjny.

Na Wydziale Chemicznym urządzenie będzie wykorzystywane przede wszystkim do badania enzymów proteolitycznych (proteaz). To wyspecjalizowane białka, które rozkładają wiązania peptydowe. Dzięki temu potrafią „pociąć” inne białka na prostsze elementy – peptydy i aminokwasy.

U ludzi proteazy stanowią grupę około 700 enzymów i biorą udział nie tylko w prostym trawieniu pokarmów, ale są także odpowiedzialne za kontrolę kluczowych procesów komórkowych  jak różnicowanie, dojrzewanie i śmierć komórki, kaskada krzepnięcia krwi czy odpowiedź immunologiczna organizmu na patogeny. Ich nieprawidłowe działanie prowadzi do powstania w organizmie stanów patologicznych. Wśród następstw są na przykład choroby cywilizacyjne takie jak nowotwory, cukrzyca, nadciśnienie czy infekcje wirusowe i bakteryjne.

Badania aktywności proteaz mają więc bardzo duże znaczenie zarówno w pracy naukowej, jak i we wczesnej diagnostyce i leczeniu pacjentów – dlatego naukowcy starają się znaleźć jak najczulsze i możliwie specyficzne markery. W prace te zaangażowani są także lekarze-naukowcy z Dolnośląskiego Centrum Onkologii we Wrocławiu i Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

Oprócz badań prowadzonych przez naszych naukowców urządzenie będzie mogło być wykorzystane komercyjnie, choćby przez firmy biotechnologiczne, które pracują nad różnego rodzaju testami diagnostycznymi.

Chcąc sprawdzić, czy opracowany test diagnostyczny działa dobrze, konieczna jest bardzo dokładna analiza danej próbki. Można ją wykonać właśnie na naszym sprzęcie, a następnie skorelować skuteczność opracowywanego testu z wynikami pozyskanymi innymi metodami – wyjaśnia dr inż. Marcin Poręba.

Wielką zaletą posiadania cytometru masowego na Politechnice Wrocławskiej jest także fakt, iż dr inż. Poręba oraz prof. Drąg we współpracy z laboratorium prof. Guya Salvesena (SBP Medical Discovery Institute, La Jolla, USA) stworzyli całkowicie nową metodę diagnostyczną, która jest niezwykle konkurencyjna pod względem aplikacyjnym i finansowym w stosunku do obecnie stosowanych przeciwciał w cytometrii masowej.

W przeciwieństwie do dużych, białkowych przeciwciał, nasza metoda polega na użyciu małych cząsteczek odpowiednio modyfikowanych metalami, które pozwalają na efektywniejsze badania diagnostyczne ze względu na ich lepszą możliwość penetracji wnętrza komórki, a także selektywność w oznaczaniu wyłącznie aktywnych enzymów. To już jest bardzo zaawansowana chemoproteomika – zaznacza prof. Marcin Drąg.

Koszt cytometru masowego to nieco ponad 3,6 mln zł, a roczny koszt użytkowania wynosi ok. 400 tys. zł. Jest to obecnie jedyne tego typu urządzenie w Polsce i trzecie w tej części Europy – podobne aparaty znajdują się jeszcze w Czechach i na Węgrzech.

 

Mikroskop w uzupełnieniu

W ramach powstającego Laboratorium Obrazowania naukowcy z Wydziału Chemicznego będą także korzystali z nowego mikroskopu konfokalnego. Będzie on wykorzystywany przede wszystkim do oznaczania parametrów komórkowych metodami fluorescencyjnymi w komórkach żywych i utrwalonych.

Jego olbrzymią zaletą jest fakt, że możemy wizualizować co najmniej cztery parametry w tym samym czasie, a więc wybarwić interesujące nas białka w czterech różnych kolorach. Urządzenie pozwala także mierzyć parametry na poziomie subkomórkowym, dzięki czemu badanie komórek może być prowadzone w rozdzielczości ok. 120 nanometrów. Jesteśmy w stanie pokazać nie tylko to, co dzieje się w komórce czy jądrze komórkowym, ale nawet w jeszcze mniejszych strukturach komórki jak jąderko czy lizosomy – podkreśla dr inż. Marcin Poręba.

Mikroskop pozwala także na obrazowanie żywych komórek i zachodzących w nich procesów, gdyż został wyposażony m.in. w komorę regulacji temperatury oraz dysze do regulacji poziomu dwutlenku węgla i tlenu. Pozwala to na mimikowanie naturalnego środowiska, dzięki czemu badane komórki się nie stresują. W niesprzyjających warunkach komórki rzeczywiście mogą się stresować, a w efekcie zostaje zaburzony ich cykl komórkowy, morfologia czy nawet zdolność do produkcji wielu białek, co znacząco wpływa na wyniki badań – wyjaśnia dr inż. Marcin Poręba.

Co ciekawe przy użyciu odpowiedniego medium hodowlanego, w tym mikroskopie, komórki mogą być podtrzymywane przy życiu nawet przez wiele dni, a to pozwala analizę procesów, które zachodzą niekiedy bardzo wolno. Koszt mikroskopu to ok. 2 mln zł.